Toxicological properties of the Thyrokitty injection (I-131) for the treatment of the feline hyperthyroidism

본 시험은 non-GLP 시험으로 실시되었으나, 한국원자력의학원 방사선비임상센터(서울특별시 노원구 노원로 75)에서 비임상시험관리기준[식품의약품안전처고시 제2018-93호(2018.11.21.)] 및 OECD Principles of Good Laboratory Practice(1997) 등 GLP 규정에 준하여 실시되었다. 또한, 농림축산검역본부고시 제2016-22호 동물용의약품등 독성시험지침 별표. 동물용 의약품등의 독성시험방법(제3조관련); (2016년 3월 9일)에 따라 시험하였으며, 한국원자력의학원 동물실험윤리위원회(IACUC, Institutional Animal Care and Use Committee) 심의를 통과하였다(심의번호: kirams2022-0080). 표준작업지침서에 따라 동물에 대한 일반적인 복지를 실시하고, 실험동물복지법, Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(by ILAR publication)에 따라 동물의 고통과 통증을 최대한 예방할 수 있는 의약적 조치를 취했다.

시험물질인 싸이로키티 주사액(I-131)은 한국원자력연구원에서 제조되었으며, 제조소의 시험 및 기준법에 따라 시험물질의 성상, 확인, pH, 방사화학적 순도, 엔도톡신, 불용성이물, 방사능량 등이 시험되었다(Supplementary Fig. S1).

시험물질인 싸이로키티 주사액(I-131)은 고용량(18.0 mCi/kg)으로 조제하고, 고용량을 이용하여 중용량(6.0 mCi/kg) 및 저용량(2.0 mCi/kg)을 3배 계대 희석하여 조제하였다. 대조물질로는 중외엔에스주사액(Jw-lifescience, Dangjin, Korea)을 사용하였다.

투여 경로는 피하투여를 선택하였다. 목덜미부위의 진피와 근육 사이에 있는 피하조직에 일회용 주사기(1 mL, 25 G 주사침)로 투여하였다. 투여량은 가장 최근에 측정한 체중에 따라 1 mL/kg로 계산하였다. 방사성 시험물질의 실제 투여량을 확인하기 위해 각 개체 별 시험물질을 소분한 주사기의 투여 전후 방사선량을 측정하여 실제 투여량을 확인하였다. 주사기의 방사선량은 시험기관의 dose calibrator를 이용하여 측정하였다. 시험물질의 단회 정맥투여 후 발현되는 독성 결과의 결과 해석 시에는 실제 투여량을 고려하여 해석하였다.

특정병원체부재(specific pathogen free) 동물로써 건강한 랫드[Sprague-Dawley/Crl:CD(SD), Orientbio, Seongnam, Korea]를 시험에 사용하였다. 5주령의 수컷 20마리와 암컷 20마리를 6일간 순화시킨 후, 투여가 시작되기 전 1일간의 투여전 기간을 두었으며, 6주령에 시험물질을 투여하였다. 미부표시법을 사용하여 개체를 식별하였으며, 가장 최근에 측정된 체중을 근거로 ‘ㄹ’자 법을 이용하여 각 군에 배치하였다.

3마리 이하로 사육상자(215 × 430 × 200 mm)에 수용하여 사육하였으며, 온도는 22 ± 3°C, 습도는 30%–70%, 조명은 12시간 명주기/12시간 암주기, 조도는 150–300 Lux, 환기 횟수는 시간당 10–20회, 청소 등은 시험시설의 표준작업지침서에 따라 실시하였다. 순화기간 6일 오전, 사육실의 습도가 허용범위인 30%–70%를 일시적으로 벗어나(최대값 80.86%) 측정되었으나, 1시간 이내에 정상범위로 회복되었다. 이후 시험기간동안 습도의 정상범위를 유지하여, 시험에 미치는 영향은 없는 것으로 판단되었다.

이 밖에 감마선이 조사된 실험동물용 고형사료(2918C, Lot No. 011022MA, Envigo, Indianapolis, IN, USA)를 자유 급여하였고, 물은 역삼투압시스템과 자외선 유수살균장치를 통과한 상수도수를 자유급여 하였으며, 감마선이 조사된 실험동물용 깔짚(7115, Lot No.160921A, 221121A, 081021A, Envigo)을 사용하였다. 사료, 물 및 깔짚에서 본 시험에 영향을 미칠만한 오염물질은 발견되지 않았다.

실험을 위한 투여 용량에 따라 Table 1과 같이 군을 구성하였다. 방사성의약품의 경우 주요한 독성이 방사선유도독성이기 때문에 방사성의약품의 실제 투여량을 고려하여 독성 시험을 실시해야 한다. 싸이로키티 주사액(I-131)은 고양이에게 최대 6.0 mCi/3 kg(고양이 평균 체중)을 치료용으로 사용할 예정이므로, 2.0 mCi/kg를 최소 투여용량으로 하고, 공비 3으로 설정하여 중용량 6.0 mCi/kg, 고용량 18.0 mCi/kg 설정하였다. 또한 생리식염수를 투여하는 Vehicle control을 설정하였다.

모든 동물을 대상으로 측정 및 관찰을 시행하였다. 관찰 기간 동안 1일 2회(작업 개시 전 및 작업 종료 후) 동물의 사망 및 빈사 상태를 관찰하였다. 사망률, 빈사, 외관 및 행동 변화 등을 포함하는 일반증상을 관찰하고, 날짜와 시간, 지속 정도 등을 확인하였으며, 체중을 측정하였다(Table 2).

모든 동물은 CO₂ 흡입을 이용하여 안락사를 시행하였다. 계획 도살된 모든 동물은 병리책임자(한국원자력의학원 장효선 박사)의 감독 아래에 부검하였다. CO₂ 흡입을 이용하여 심마취후, 후대정맥과 복대동맥을 절단하여 방혈치사 시켰다. 외관상 비정상 유무를 상세히 관찰하고 복강 및 흉강의 비정상 유무를 관찰하였다.

이번 실험의 모든 결과는 Microsoft excel, GraphPad Prism(Prism 5 version 5.01, GraphPad Softward, San Diego, CA, USA) 및 Statistical Package for the Social Sciences(SPSS version 23.0, Chicago, IL, USA)를 이용하여 각 그룹 간 통계학적으로 유의미한 차이를 분석하였다. 일표본 Kolmogorov-Smirnov Z Test를 실시하여 정규성을 검정한 후, 정규성이 확인되면 일원배치분산분석(ANOVA)으로 검정하였다. 군간 차이는 Levene test로 등분산검정을 실시하여 등분산이 가정되면 Tukey 다중비교를 실시하였다. 정규성이 만족하지 않은 경우 Kruskal-Wallis T 검정을 실시하였다.

싸이로키티 주사액(I-131)은 방사성요오드(¹³¹I)가 단일 유효성분이기 때문에, 시험물질이 약리적 효과를 발휘하기 위해서는 방사성요오드(¹³¹I) 핵종에 대한 확인과 방사화학적 순도의 확인이 필수적이다. 품질 확인 결과, 싸이로키티 주사액(I-131)은 방사성요오드(¹³¹I)의 주피크인 0.364 MeV가 확인되고 방사화학적 순도 또한 95% 이상으로써 일반적으로 방사성의약품에 요구되는 기준을 충족하였다(Supplementary Fig. S1).

시험물질의 투여 전후 방사능량을 측정하여 실제 투여된 방사능량을 확인한 결과, T2군의 31, 32, 35번 동물과 T3군의 20번 동물에 오차허용 한도(± 10%)를 벗어난 방사능량(각각 111.2%, 110.2%, 133.8%, 136.4%)이 투여되었다. T2군과 T3군의 투여 계획용량에 비해 더 높은 용량으로 투여된 것으로, 관찰 및 측정 결과 T2군과 T3군의 모든 동물에서 시험물질 투여에 따른 체중 및 일반증상 변화가 관찰되지 않았으므로 시험에 미치는 영향은 없다고 판단되었다.

본 시험에서 시험물질의 주사 후 사망한 개체는 없었다(Table 3, Supplementary Table S1).

수컷의 경우 T3(18.0 mCi/kg)군의 1개체(동물번호 16)에서 Day 15에 경도의 가피형성(직경 1 cm 미만)이 관찰되었다. 관찰된 피부병변들은 부검 시에 상처로 확인되었다(Table 4, Supplementary Table S2, S3). 암컷에서는 또 다른 T3(18.0 mCi/kg)군의 1개체(동물번호 38)에서 투여 10일 후부터 경도의 탈모가 관찰되어 분리사육하였으며, 투여 13일 후부터는 경도의 열창(직경 1.5 cm 미만)으로 관찰되어 부검시까지 지속되었다(Table 5, Supplementary Table S4, S5).

투여 당일 일반증상 관찰을 1일 7회 수행하는 것으로 계획하였으나, 마지막 투여 직후 일반증상을 추가 관찰하여 총 8회 관찰하였다. 일반증상 관찰의 1회 추가로 인한 일탈로써 추가 조치 없이 해당 데이터를 채택하였다. 일반증상 관찰의 1회 추가 관찰로 인한 일탈이므로 시험에 미치는 영향은 없었다.

시험기간 동안 통계적으로 유의한 체중 변화는 관찰되지 않았다(Table 6 and 7, Supplementary Table S6–S9, Fig. S2–S3).

Table 8 및 Supplementary Table S10과 같이 T3(18.0 mCi/kg)군의 1개체에서 왼쪽 등에 경도의 열창(직경 1.5 cm 미만)과 T3(18.0 mCi/kg)군의 1개체에서 오른쪽 등에 경도의 가피(직경 1 cm 미만)를 확인하였으나, 일반증상에서 관찰된 증상이 지속된 것으로 시험물질과 관련된 소견은 아닌 것으로 판단된다. V.C군의 1개체, T2(6.0 mCi/kg)군의 2개체에서 위 위축 소견이 관찰되었으며, T3(18.0 mCi/kg)군의 3개체에서 비장 크기의 감소가 관찰되었다. 이러한 위 위축과 비장 크기의 감소가 관찰된 개체는 타 개체와 비교하여 체중이 적게 측정되었다.